单细胞国自然标书模板之研究内容和拟解决问题 | 单细胞专题
昨天为大家带来了一份简易的单细胞测序相关基金标书的模板之摘要和约4000-8000字左右的立项依据 单细胞国自然标书模板之立项依据(综述前言) | 单细胞专题
今天继续为大家带来一份简易的单细胞测序相关基金标书的模板之研究内容和拟解决关键问题，部分内容较为简易，整份材料以搭建框架为主，具体内容仍然需要老师自行填写，仅供参考。我们还在后面附上了较为传统的生化类标书的参考模板供老师模仿。
2、项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题。
（1）研究内容
① 乳腺癌组织常驻免疫细胞单细胞转录组图谱构建
为了生成人类乳腺癌中免疫细胞状态的深层转录图，我们打算构建了一个单细胞图谱合集，初步包含47份CD45+细胞，这些细胞是从8种原发性乳腺癌患者（包括雌激素受体（ER+）和孕激素受体（PR+阳性）中收集的表皮生长因子受体2扩增（HER2+）和三阴性（TNBC）癌症。为了评估跨乳腺癌亚型的肿瘤微环境对免疫细胞表型的共同影响，我们还搜集并分析了来自配对的正常乳腺组织、外周血以及从新鲜手术获得淋巴结中的CD45+细胞。接下来对这些CD45+细胞，利用10X Genomics的Chromium芯片进行单细胞转录组测序和VDJ免疫组测序。
② 改进新算法构建乳腺肿瘤免疫细胞图谱揭示了免疫细胞多样性
为了构建完整的免疫细胞图谱，我们将会对所有测序结果进行整合分析，通过我们自己开发的算法使用交叉验证测试其可靠性。为了准确定义每一个细胞亚群或类型，我们采用机器学习方法将已发表的大量单细胞数据集进行了比较，从而能够更好的标记处T细胞、B细胞以及NK细胞的各个亚型。
③ 组织微环境影响免疫表型多样性
为了量化免疫表型变异由其居住组织驱动的程度，使用tSNE算法对不同组织中的免疫细胞进行聚类。
④ 不同微环境决定肿瘤内T细胞Cluster的特征
前期研究表明，驻留于肿瘤的T细胞可能暴露于不同程度的炎症环境，并处于缺氧和营养缺乏状态。我们前期通过的反卷积分析推测，缺氧等状态会激活T细胞，导致后期聚类的时候样本间更加离散。我们希望通过单细胞测序验证这种猜想。
⑤ 激活和分化阐释瘤内骨髓细胞变异
尽管髓样细胞是肿瘤微环境的关键组成部分，但它们的异质性及其对肿瘤进展的影响仍然证据不足。我们寄希望于通过单细胞测序来进一步提供更多的证据。
（2）研究目标：
① 改进的单细胞生信算法能够鉴定多个肿瘤微环境中共有的和独有的细胞亚群，并确定对临床影响最大的细胞亚群
② 证实肿瘤组织中免疫细胞是免疫表型的重要决定因素，基于血液免疫细胞的生物标志物不一定反映肿瘤中免疫细胞的组成；
③ 证实在肿瘤内发现的细胞状态异质性增加可能是由肿瘤内更多样化的局部微环境引起
④ 证实T细胞常规分类成相对较少的离散激活或分化亚型大大简化了组织中T细胞群体的表型复杂性
⑤ 证实基因的共变异在定义T细胞Cluster，尤其是Treg Cluster方面发挥重要作用
⑥ 证实TCR多样性以及其他因素均是维持T细胞活化持续性的驱动因素
⑦ 证实抗原性TCR刺激和环境刺激的结合可能会影响表型状态
⑧ 证实不同细胞Cluster基因共表达模式在定义髓样细胞状态中的重要性
（3）拟解决的关键科学问题
① 在现有生信算法基础上，开发升级全新的单细胞生信算法
② 证实肿瘤组织中免疫细胞对免疫表型鉴定的不可替代性
③ TCR和T细胞亚群鉴定的关键因素以及对乳腺癌术后进展影响
辅助材料————项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题传统标书参照模板
（1）研究内容
1）在人类组织学水平上验证XXX分子与疾病的相关性
为了验证XXX是否与XXX疾病具有相关性，我们收集XXX例该疾病的临床样本，并使用qPCR、Western Blot、免疫组化等等方法，分别检测XXX分子在mRNA水平、蛋白质水平的表达情况以及组织中的分布等。根据所收集到的实验结果，分析该分子是否与该疾病存在显著的相关性。
2）在动物水平上验证XXX对XXX疾病动物模型的保护性作用及可能的作用机制
为了验证XXX是否能够影响XXX疾病的发生、发展过程，我们使用XXX诱导XXX疾病动物模型，并检测XXX在不同疾病动物中的变大差异。同时给予动物XXX相关的治疗，然后分别收集不同组动物的哪些样本，使用什么方法做哪方面的相关等。
分离XXX疾病动物相关细胞，检测XXXX的变化是否影响细胞的相关功能，如增殖、迁移、分化等。
3）在细胞水平上明确XXX在该疾病过程中可能的机制
为了进一步明确XXXX在XXX疾病过程中的详细机制，我们使用XXX细胞（细胞系或者分离的原代细胞），给予细胞什么处理或者怎么分组，培养多久后做哪些相关方面的检测。如收集细胞总蛋白，检测蛋白表达；收集细胞总RNA检测基因表达变化；收集细胞做细胞功能检测等。最终通过该部分实验明确XXX是通过什么机制在XXX疾病过程中发挥作用的。
4）在动物水平上验证XXX作为XXX疾病治疗的可行性
为了明确XXX分子或者其调控的XXX信号通路是否可以作为XXX疾病药物治疗的靶点，我们使用XXX（可以是蛋白分子或者信号通路的抑制剂等）作为药物给予疾病动物治疗，治疗后收集不同的样本，检测相关的疾病指标，最终明确是否XXXX或者其调控的XXX信号通路可以作为XXX疾病治疗的靶点。
（2）研究目标：
1）明确XXX是否与XX疾病的发生和发展具有临床上的相关性；
1）明确XXX是否对XX疾病具有保护性或促进性作用；
2）确定XXXX调控XXX功能可能的信号通路或关键性的靶点分子；
3）验证XXX作为XX疾病药物治疗靶点的可行性。
（3）你解决的关键科学问题
1）明确XXX是否与XX疾病在临床上存在相关性；
2）成功构建XXX实验检测系统/实验方法等；
3）明确XXX是如何通过参与XXX信号通路来发挥其对疾病的影响作用的。
最后，强烈推荐你阅读我们首发的《单细胞测序工具书》，你需要的国自然单细胞项目申请材料统统都在这本书里。